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層析柱的一些總結(jié)介紹

多數(shù)微生物堿性蛋白酶不耐熱,堿土金屬,特別是鈣對(duì)堿性蛋白酶有明顯的熱穩(wěn)定作用 堿性蛋白酶是加酶洗滌劑的主要添加劑之一,在絲綢、制革工業(yè)中也有廣泛用途   
熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于不同的溫度條件下(30℃,40℃,50℃,60℃,70℃)保溫 10min 后,立即在 0℃冰浴中冷卻,然后在 40℃下測(cè)堿性蛋白酶活力,以剩余的酶活性作為評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。測(cè)量三個(gè)重復(fù)求平均值,將**高的酶活力定義為 100%,分別計(jì)算不同溫度條件下蛋白酶的剩余酶活性與**高酶活性的比值。  
以ph7的緩沖液為例,如果你的目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)小于7,呢就帶負(fù)電荷,用陰離子交換的柱子,如果是大于7,那選擇陽離子交換的柱子,如果等電點(diǎn)是7,那上樣的緩沖液pH大于它的等電點(diǎn)用陰離子,小于7的用陽離子,如此類推就可以 
緩沖液的PH=pI值+1,上陰離子柱,=pI值-1,上陽離子柱,一般緩沖液ph范圍在6.5~8.5之間,與PI值相差1個(gè)PH是比較理想的。 
如果不清楚PI值,可以將蛋白溶到PH梯度的緩沖液里,然后分別試陽離子和陰離子填料(50ul左右得體積就夠了),看那個(gè)PH下掛得好。 
強(qiáng)離子交換劑: 在寬pH范圍內(nèi)載量穩(wěn)定,所以他的優(yōu)點(diǎn)是不同pH下載量恒定,可控性好,平衡過程快速、簡(jiǎn)單。 
弱離子交換介質(zhì)的缺點(diǎn):適用的pH范圍比較小,隨著pH不同載量發(fā)生變化。但是大部分蛋白等電點(diǎn)在5.5 ~ 7.5 。因此強(qiáng)/弱離子交換介質(zhì)都可以使用 
弱離子交換介質(zhì)(DEAE、ANX、CM)優(yōu)點(diǎn)在于:和強(qiáng)離子交換介質(zhì)的選擇性不同,因此我們一般先使用強(qiáng)離子交換,如果優(yōu)化條件還是達(dá)不到理想的分離效果,可以嘗試弱離子交換,用選擇性不同的介質(zhì)嘗試一下。 
因此弱離子交換與強(qiáng)離子交換由于選擇性不同,可以說是對(duì)不同蛋白的結(jié)合力有差異。S  
技術(shù)規(guī)格 離子交換劑類型 
Q Sepharose FF                    季氨基,強(qiáng)陰離子 DEAE Sepharose FF              二乙基氨基乙基,弱陰離子 ANX Sepharose 4FF              二乙基氨基丙基,弱陰離子 SP Sepharose FF                    磺丙基,強(qiáng)陽離子 CM Sepharose FF                    羥甲基,弱陽離子 離子容量 
Q Sepharose FF                0.18-0.25mmol(Cl-)/ml DEAE Sepharose FF               0.11-0.16mmol(Cl-)/ml ANX Sepharose 4 FF               0.13-0.18mmol(Cl-)/ml SP Sepharose FF                0.18-0.25mmol(H+)/ml CM Sepharose FF                 0.09-0.13mmol(H+)/ml 動(dòng)態(tài)載量 
Q Sepharose FF                    120mg HSA/ml 填料 DEAE Sepharose FF                 110mg HSA/ml 填料 ANX Sepharose 4 FF              5mg 甲狀腺球蛋白/ml 填料 SP Sepharose FF                  70mg RNAase/ml 填料 CM Sepharose FF                  50mg RNAase/ml 填料 
壓力/流速 
Q Sepharose FF     400-700cm/h,100kpa,XK50/30層析柱,柱床高15cm DEAE Sepharose FF    300-600cm/h,100kpa,XK50/30層析柱,柱床高15cm ANX Sepharose 4 FF   **少200cm/h,100kpa,XK50/60層析柱,柱床高25cm  SP Sepharose FF     400-700cm/h,100kpa,XK50/30層析柱,柱床高15cm CM Sepharose FF     300-600cm/h,100kpa,XK50/30層析柱,柱床高15cm  
平均顆粒大小                     90um(45-165um)   基質(zhì) 
Sepharose FF                    高度交聯(lián)瓊脂糖,6% Sepharose 4 FF                  高度交聯(lián)瓊脂糖,4%   
PH穩(wěn)定性 
Q Sepharose FF                1-14(短期),2-12(長(zhǎng)期) DEAE Sepharose FF              1-14(短期),2-13(長(zhǎng)期) ANX Sepharose 4 FF              2-14(短期),3-13(長(zhǎng)期) SP Sepharose FF               3-14(短期),4-13(長(zhǎng)期) CM Sepharose FF                2-14(短期),4-13(長(zhǎng)期)   
化學(xué)穩(wěn)定性                        
在所有常用的水溶液緩沖液中穩(wěn)定:8M尿素、6M鹽酸胍、70%乙醇、1M NaOH和1M醋酸 20%乙醇(Q , DEAE,ANX,CM ),含0.2M醋酸鈉的20%乙醇(SP)  
保存                  
保存溫度                        4℃-30℃ l 1M NaOH和醋酸僅在清洗時(shí)使用 
  
Phenyl-Sepharose HP 產(chǎn)品名稱:苯基-瓊脂糖凝膠 6FF 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),快流速,適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:苯基-瓊脂糖凝膠 H.P. 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析填料 粒    徑: 24-44µm 工作PH值:3-13 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),高分辨率,適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:苯基-瓊脂糖凝膠 CL-4B 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析填料 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),適合生物大分子和疫苗的分離純化等。 產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖凝膠 4FF 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),快流速,適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖凝膠 H.P. 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 24-44µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),高分辨率,適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖凝膠 4B 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:4-8 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:辛基-瓊脂糖凝膠 4FF 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),快流速,適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱:辛基-瓊脂糖凝膠 H.P. 性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 24-44µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),高分辨率,適合生物大分子和疫苗的分離純化等
產(chǎn)品名稱:辛基-瓊脂糖凝膠 CL-4B  性    狀:白色微球 凝膠類型:疏水層析介質(zhì) 粒    徑: 45-165µm 工作PH值:3-13 
應(yīng)    用:疏水層析介質(zhì),適合生物大分子和疫苗的分離純化等 HPLC內(nèi)容: 
1、反相柱子:一般適用范圍比較大。分離極性比較小的物質(zhì)。極性強(qiáng)的物質(zhì)先出柱。 ODS就是C18柱子。 
RP-8和RP-18分別是C18柱子和C8柱子。 C18柱子和C8柱子是柱子的碳鏈的長(zhǎng)度不一樣的。 
碳鏈增長(zhǎng)了,也增加了鍵合相的非極性作用的面積,對(duì)保留值和選擇性都有影響,隨烷基碳鏈的增長(zhǎng)對(duì)溶質(zhì)分離的選擇性也增強(qiáng)了.但是對(duì)單一或簡(jiǎn)單組分確實(shí)看不出太大區(qū)別。 
2、正相柱子:一般分離光學(xué)異構(gòu)體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)。 APS為NH2柱子 
另外diol 代表的是球形硅膠鄰二羥基丙基醇基柱,正相柱,極性強(qiáng)的物質(zhì)后出。 
硅膠柱子的特點(diǎn)是可分離異構(gòu)體,柱子的載樣量大,用于制備分離,不污染收集的流分了,缺點(diǎn)是分析應(yīng)用不方便,如流動(dòng)相的含水量應(yīng)該嚴(yán)格控制,再現(xiàn)性較差,需較長(zhǎng)的平衡時(shí)間,不適用于梯度洗脫。 堿性化合物在氨基和二醇柱上的保留強(qiáng),而偶極化合物在腈基柱子上的保留強(qiáng)。 建議您看看色譜分析等專業(yè)書籍有幫助的。    ODS-A  
  ODS-A液相色譜柱是*際上是銷售**好的一種傳統(tǒng)色譜柱,同時(shí)也是HPLC中應(yīng)用**廣泛的應(yīng)用。YMC ODS-A液相色譜采用高度封端的表面結(jié)構(gòu)和具有適當(dāng)?shù)氖杷?,廣泛地應(yīng)用于多種化合物的分離。在嚴(yán)格質(zhì)量控制體系下,對(duì)50個(gè)以上的參數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制, 保證了穩(wěn)定的質(zhì)量。其通常作為液相色譜標(biāo)準(zhǔn)柱。  ODS-AM  
  ODS-AM液相色譜柱是一種高碳含量的C18柱,具有和ODS-A液相色譜柱相似的選擇性。二者的主要區(qū)別是ODS-AM液相色譜柱采用的是**的封端技術(shù),采用十分嚴(yán)格的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范,可提供優(yōu)良的峰對(duì)稱性和更高分離效果的重現(xiàn)性,從而改善較難分離組分的峰形。  ODS-AQ  
  ODS-AQ液相色譜填料具有中等強(qiáng)度的疏水性和氫鍵鍵合相色譜填料,由于其具有相對(duì)高的疏水性,其與ODS-A相比有不同的保留行為,其主要用于碳水化合物的分離,如寡聚多糖類、葡萄糖苷類、藥物和天然化合物的分離。  ODS-AL  
  ODS-AL液相色譜柱不僅具有疏水基團(tuán)的相互作用,而且還具備由硅醇基產(chǎn)生的第二級(jí)相互作用,這使其與傳統(tǒng)的ODS不同的選擇性。當(dāng)離子間相互作用被優(yōu) 化后,特別推薦用于流動(dòng)相中含有緩沖液的色譜分離,可以獲得高重現(xiàn)性的色譜圖。YMC-Pack ODS-AL液相色譜柱采用的是沒有封端的高碳含量單層C18相,其只能在殘存的硅醇基活性有利于色譜分離時(shí)使用,由于容易發(fā)生拖尾峰,不推薦在分析胺類 或含堿性基團(tuán)的化合物中使用。  ODS H80, M80, L80  
ODS液相色譜填料是一種以硅膠為載體的三種配基覆蓋率不同的 ODS填料,不同配基覆蓋率將影響?zhàn)s出物中疏水組分的保留行為,餾出物的官能基團(tuán)或三級(jí)結(jié)構(gòu)將決定分離行為的結(jié)果。J'sphere ODS液相色譜填料幾乎不需要考慮疏水性和氫鍵鍵合相之間的相互作用,如離子或相互作用,其多用于分離條件的測(cè)定。   
色譜柱考慮的問題shou 先是填料的問題,大多數(shù)用于HPLC分離的柱填料使用硅膠填料,基于多孔聚合物擔(dān)體與鍵和的有機(jī)表層(如C18&C8),應(yīng)用范圍較廣,顆粒的大小(粒 度)在HPLC中極為重要,約5um的微粒直徑兼顧了分析柱的柱效,反壓和壽命。更小的多孔微粒對(duì)快速分離很有用。小**1.5um的薄殼微粒對(duì)極快速地分 離蛋白質(zhì)等大分子較有用。較窄地粒度分布能保證填充床地穩(wěn)定、高效和壓力降**小。總的來說,3或5um全多孔微球填充HPLC色譜柱,能滿足大多數(shù)分離地 需要。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
色譜柱地性能指標(biāo)主要考慮:理論塔板數(shù),峰不對(duì)稱因子(AS),兩種不同溶質(zhì)地選擇性,色譜柱地反壓,保留值地重現(xiàn)性,鍵和相濃度,色譜柱地穩(wěn)定性。  
有幾點(diǎn)看法: 
1)本人認(rèn)為,C18是連接了18烷基碳鏈的反相固定相的總稱.ODS 是以硅膠為基質(zhì)鍵合的C18填料,而C18還包括其他基質(zhì)的填料,比如高聚物小球?yàn)榛|(zhì),氧化鋁為基質(zhì),氧化鋯為基質(zhì)等鍵合C18鏈形成的反相固定相,這些可以稱為"C18",但是不是ODS. 
2)RP- 18也是C18中的一種,不同的公司對(duì)C18填料有不同的商業(yè)名稱,本質(zhì)應(yīng)該都是一樣的.Merck公司的填料喜歡叫RP-18. 比如Merck 的LiChrospher RP-18, Superspher RP-18,Purospher RP-18. 因此,我認(rèn)為說"RP-18"是改進(jìn)型的不妥當(dāng).Merck的改進(jìn)表現(xiàn)在前邊的名字上,比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表現(xiàn)的是不同的性能. 
3) "普通ODS分析酸性、中性或弱堿性化合物時(shí)均可以獲得較佳的峰不對(duì)稱度。但當(dāng)分析藥物化合物中的強(qiáng)極性含氮的堿性樣品時(shí),樣品峰形就極差,拖尾嚴(yán)重,定 量分析精度下降",這句話我認(rèn)為值得商榷.普通的ODS,在分離中性化合物,極弱性的酸或鹼化合物的時(shí)候可以得到較好的峰形,對(duì)于弱**中等極性的酸堿化合 物,多數(shù)情況下會(huì)出現(xiàn)不同程度的拖尾.對(duì)于強(qiáng)極性化合物,不單是藥物,其他化合物一樣,都會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象  
再次修改,除掉了不太相關(guān)的BDS,應(yīng)該說論述比較全面了。 C18(C-18)、RP18(RP-18)、ODS有什么區(qū)別? 
答:C18(C-18)、ODS、RP18(RP-18)的寫法一般人從表面上理解沒多大的區(qū)別,三者之間常?;煊茫诰唧w的不同場(chǎng)合,從嚴(yán)格意義上講,還是有一定的區(qū)別。 
一般認(rèn)為C18是連接了18烷基碳鏈的反相固定相的總稱,除了硅膠基質(zhì)外,還可以包括其他基質(zhì)的填料,比如高聚物小球?yàn)榛|(zhì),氧化鋁為基質(zhì),氧化鋯為基質(zhì)等鍵合C18鏈形成的反相固定相。 
而ODS 是以硅膠為基質(zhì)鍵合的C18填料。因?yàn)榇蟛糠值腃18柱是硅膠基質(zhì),因此,在很多場(chǎng)合內(nèi)二者混為一體。 
ODS其后所標(biāo)的1、2、3、4、5有的是指含碳的不同,有的是不同代的替換產(chǎn)品,如Spherisorb的ODS-1是指未經(jīng)封尾處理的,含碳量為5.75%,ODS-2是經(jīng)封尾處理的,含碳量為11.5%。不同廠家的ODS柱性能差異很大。 
RP 在不同廠家中使用的含義也不太一致,在waters的色譜柱中,RP18(8)是指經(jīng)過改進(jìn)的新型C18(8)柱,其不同在于在經(jīng)典直鏈配體之間內(nèi)嵌極性 基團(tuán),其選擇性同C18(8)有了很大的差異,特別是對(duì)含酚基官能團(tuán)的化合物。Agilent的Bonus-RP柱中RP的含義同Waters。但是在 Merck公司的色譜柱中,RP-18同C18意義相同,包括硅膠基質(zhì)、氧化鋁基質(zhì)、及一體化的Chromolith柱。 
因此,光從C18(C-18)、RP18(RP-18)、ODS很難區(qū)別不同廠家色譜柱之間結(jié)構(gòu)上的差異,**好從有關(guān)廠家的資料中尋找。

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