離子交換層析（色譜） 一、原理
離子交換層析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的層析法。
荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：
I — 流動相的離子強度，A和B為常數(shù)， 為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。 離子交換基： 陰離子：DEAE（二乙胺乙基）； QAE（季胺乙基） 陽離子：CM（羧甲基）；SP（磺丙基）
對于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，在物理意義上，B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子價數(shù)之比。在pH偏離等電點的溶液中，蛋白質(zhì)溶質(zhì)的靜電數(shù)常為兩位數(shù)以上，故B值較大，即蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強度非常敏感。在同一離子強度下，不同蛋白質(zhì)的分配系數(shù)相差非常大（幾個數(shù)量級）。 洗脫方式：
恒定洗脫法：洗脫液（流動相）的離子強度不變；
缺點：對于在吸附柱上分配系數(shù)相差較大的蛋白質(zhì)很難實現(xiàn)很好的分離。 線性梯度洗脫法或階段梯度洗脫法：
除GFC以外的層析操作均采用此種方法。
在洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大或階段梯度增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于脫附的溶質(zhì)得到洗脫。 線性梯度洗脫和階段梯度洗脫法的優(yōu)缺點如下： （1）線性梯度洗脫法：
優(yōu)點：流動相離子強度（鹽濃度）連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣； 缺點：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。 （2）階段梯度洗脫法：
優(yōu)點：利用切換不同鹽濃度的流動相溶液進行洗 脫，不需要特殊梯度設(shè)備，操作簡單； 缺點：因為流動相濃度不連續(xù)變化，容易出現(xiàn)干擾峰。
此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象，因此洗脫操作參數(shù)（如鹽濃度體積）的設(shè)計較困難。 離子交換(IEC)的應用及特點
GFC — 主要用于產(chǎn)物的初步純化和中后期脫鹽
IEC — 是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段 IEC分離的特點：
（1）料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；
（2）應用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長較短； （3）產(chǎn)品回收率高；
（4）商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠低于親合吸附劑。
疏水作用層析（色譜） 一、原理
疏水作用層析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團的疏水吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。
二、疏水性吸附劑：將下表所列的各種凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)上疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。
常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特點：
疏水性吸附作用的大小與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。一般配基修飾密度在10 ~ 40?mol/ml，配基修飾密度過小則疏水性吸附不足，密度過大則洗脫困難。
三、HIC操作
上樣及洗脫的一般規(guī)律：
在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來。一般用pH 6-8的鹽水溶液[如（NH4）2SO4]。鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的疏水性，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。
鹽：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl --〉 鹽析作用增強 《-- 洗脫能力增強
1、影響疏水性吸附的因素 蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)(疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度)外，流動相的組成以及操作溫度對蛋白質(zhì)疏水性吸附的強弱均產(chǎn)生重要影響。
(1)離子強度及種類 蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大。離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。因此HIC分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動相，在略低于鹽析點的鹽濃度下進料，然后逐漸降低流動相離子強度進行洗脫分離。 (2)破壞水化作用的物質(zhì)
, ,和 等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用。這類陰離子與上述鹽析作用強的高價陰離子(如 ， 等)的作用正好相反，前者稱為離液離子(chaotropic ion)，后者稱為反離液離子(antichaotropic ion)。在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。 #p#分頁標題#e#
除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用，經(jīng)常用做洗脫促進劑，洗脫疏水吸附強烈、僅靠降低鹽濃度難于洗脫的高疏水性蛋白質(zhì)。
(3)表面活性劑 表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質(zhì)可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用HIC法進行洗脫分離。但此時選用表面活性劑的種類和濃度應當適宜：濃度過小則膜蛋白不溶解，過大則抑制蛋白質(zhì)的吸附。 (4)溫度
一般吸附為放熱過程，溫度越低吸附結(jié)合常數(shù)越大。但疏水性吸附與一般吸附相反，吸附結(jié)合作用隨溫度升高而增大。蛋白質(zhì)疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸熱過程，即疏水性吸附為吸熱過程, ?0 因為： 所以吸附平衡常數(shù)K隨溫度的升高而增大。
2，蛋白質(zhì)的分離
蛋白質(zhì)與HIC填料之間的作用很復雜，有時不能完全用疏水性相互作用來解釋，有時配基苯環(huán)還會與蛋白質(zhì)分子上的芳香族氨基酸產(chǎn)生?-?鍵。因此，在利用HIC分離蛋白質(zhì)混合物時，需事先利用各種小型預裝柱進行吸附與洗脫實驗，確定**佳吸附劑和洗脫劑。 3，HIC的特點
HIC主要用于蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化。雖然HIC不如IEC應用昔遍，但可作為IEC的補充工具。如果使用方法適當，HIC具有與IEC相近的分離效率．歸納而言，H1C具有如下特點：
(1) 由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此，HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液； (2) 可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，因此此可根據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；
（3) 疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當。 羥基磷灰石層析
羥基磷灰石（hydroxyapatite, HAP): 是一種磷酸鈣晶體，基本分子結(jié)構(gòu)為 一般認為，HAP的吸附主要基于鈣高子和磷酸根離子的靜電引力，即在HAP晶體表面存在兩種不同的吸附晶面，各存在吸附點c點和P點，前者起陰離于交換作用，后者起陽離于交換作用．因此，在中性pH環(huán)境下酸性蛋白質(zhì)(pI<7)主要吸附于c點，堿性蛋白質(zhì)(PI>7)主要吸附于P點．利用磷酸鹽緩沖液(K2HP04+KH2PO4）為流動相洗脫展開時，磷酸根離子在c點競爭性吸附，交換出酸性蛋白質(zhì)，而K+在P點競爭性吸附，交換出堿性蛋白質(zhì)。所以HAP層 析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法。 應用：
由于HAP晶體表面結(jié)構(gòu)特別，吸附機理特殊，因此可用于識別DNA及RNA的單鏈和雙鏈，分離IEC和HIC難于分離的蛋白質(zhì)物系。例如，人腫瘤壞死因子(human tumour necrosis factor,hTNF)的構(gòu)成蛋白質(zhì)分子差異很小, 利用IEC法、高效RPC法和電泳法只能得到一個洗脫峰或電泳帶，而利用HAP層析可分離得到4個洗脫峰。
HAP吸附劑價格便宜，遠低于高子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克降抗體的主要純化手段。
灌注層析(Perfusion chromatography)
灌注層析(Perfusion chromatography)是美*PerSeptive Biosystems公司于1989年開發(fā)的層析分離技術(shù)，Perfusion chromatography是該公司的注冊商標．灌注層析的關(guān)鍵是其以POROS命名的固定相粒子的特殊結(jié)構(gòu)；POROS的基質(zhì)是聚苯乙烯—二乙烯苯，含有兩種大小不同的孔道。大孔直徑為0.6 ~ 0.8?m，流體以對流形式通過，稱為穿透孔(throughpore); 小孔直徑與一般介質(zhì)一樣，直徑500 ~ 1000 ， 流體以擴散的形式通過，稱為擴散孔(diffusive pore)．如圖所示，穿透孔之間以擴散孔相連，保證了
POROS介質(zhì)的大比表面積和溶質(zhì)吸附容量。同時，擴散孔道長度小于l?m，溶質(zhì)擴散所需時間極短，大大降低了利用傳統(tǒng)介質(zhì)進行層析分離的擴散傳質(zhì)阻力。
吸附劑體積： 1.25 L (?25?252) 上樣液： 80ml，lmg rTAP／ml
沖洗：用相當于3倍柱體積的平衡液(0.1mol／L NaCl，0.05 mol／L富馬酸鈉，pH3.5)清洗 洗脫：用洗脫液(0.5mol／L NaCl，0.05mol／L富馬酸鈉，pH3.5)洗脫，第二個峰即為純化的rTAP，收率為93.4％。
層析聚焦（Chromatofocusing)
層析聚焦是基于離子交換的原理，根據(jù)兩性電解質(zhì)分子間等電點的差別進行分離純化的洗脫層析法.
層析聚焦利用離子交換劑為固定相，因此是一種離子交換層析法。但是，與一般IEC所不同的是，層析聚焦利用在較寬pH值范圍內(nèi)具有緩沖作用的多緩沖離子交換劑為固定相，同時利用在較寬pH值范圍內(nèi)具有緩沖作用的多緩沖劑為流動相。所以，當向?qū)游鲋鶅?nèi)通入與柱內(nèi)初始pH值不同的多緩沖劑時，柱內(nèi)pH值緩慢改變，在軸向形成連續(xù)的pH梯度，使料液中的溶質(zhì)依據(jù)各自的等電點或者吸附，或者脫附，逐次向下移動，彼此之間得到分離。 多緩沖劑：
多緩沖劑是兩性電解質(zhì)緩沖劑，由相對分子質(zhì)量大小不一的各種多羧基多氨基化合物組成，存在各自的等電點。常用的多緩沖劑有Pharmacia公司生產(chǎn)的Polybuffer 96、Polybuffer 74和Pharmalyte等，緩沖pH范圍分別為pH 9-6，pH 7-4和pH 10.5-8。在相應的緩沖pH范圍內(nèi)，各種多緩沖劑具有均衡的緩沖容量，在層析聚焦操作中提供平滑的pH梯度。 多緩沖離子交換劑: 可利用普通的凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)特殊的離子交換基制備．如Pharmacia公司生產(chǎn)的PBEll8和94即為以Sepharose 6B為載體的陰離子交換劑，前者與Pharmalyte 匹配使用，后者與Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。 #p#分頁標題#e#
Pharmacia生產(chǎn)的另一種多緩沖離子交換劑為Mono P，其離于交換基為具有不同pKa值的弱堿性胺基．MonoP可與上述三種多緩沖劑匹配使用，粒徑僅10?m，用作高效層析聚焦柱的固定相。
層析聚焦的應用
層析聚焦需使用特殊的固定相和流動相，難于應用在大規(guī)模分離純化過程，主要用于生化實驗規(guī)模的樣品制備或成分分析．但作為一種蛋白質(zhì)分離純化手段，層析聚焦的純化效率極高，峰寬可小到0.02 – 0.05pH單位，可分力電點差僅0. 02的蛋白質(zhì)。
