根據(jù)對(duì)生物產(chǎn)物分離工程的學(xué)習(xí)及所做的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，我對(duì)這方面的知識(shí)有了粗淺的認(rèn)識(shí)。根據(jù)所學(xué)知識(shí)我發(fā)現(xiàn)生物產(chǎn)物分離的方法多種多樣，不同產(chǎn)物其分離方法不同，同種產(chǎn)物又有多種分離方法。就所做的實(shí)驗(yàn)而言，我對(duì)層析法分離蛋白比較感興趣。以下是我對(duì)這種方法的了解：
層析法是分離蛋白質(zhì)通用的方法。其原理都是通過蛋白質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的性質(zhì)不同而達(dá)到分離的效果。層析法可分為紙層析法，凝膠過濾層析法，離子交換層析法等。凝膠過濾層析法**為常用，在分離蛋白質(zhì)時(shí)只需要把蛋白質(zhì)混合液加到凝膠珠的上部，并加少許洗脫液來產(chǎn)生一定的液壓是蛋白質(zhì)能向下運(yùn)動(dòng)，在凝膠柱底部用試管接流下來的蛋白質(zhì)液體，進(jìn)行比色。此種方法很簡(jiǎn)單，不需要貴重儀器，但分離的蛋白質(zhì)不是很好，這些液體仍然是很多蛋白質(zhì)的混合液，通過比色來確定目的蛋白含量的**高值。這種方法只能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行一些粗篩。
近期做了一個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用到了凝膠層析即凝膠柱層析分離蛋白質(zhì)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是運(yùn)用凝膠層析 分離藍(lán)色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意：1、裝柱時(shí)要注意凝膠的流速，不宜過快，同時(shí)要保證凝膠能充分的沉淀且分布的比較均勻; 2、凝膠溶脹所用的溶液應(yīng)與洗脫用的溶液相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化而影響分離效果; 3、樣品的濃度和加樣量的多少。是影響分離效果的重要因素。樣品濃度應(yīng)適當(dāng)大，但大分子物質(zhì)的濃度大時(shí)，溶液的黏度也隨之變大，會(huì)影響分離效果，要兼顧濃度與黏度兩方面。加樣量和加樣體積越少分離效果越好，加樣量一般為柱床體積的1%-2%，制備用量一般為柱床體積的20%-30%；4、凝膠用完后可再加入防腐劑低溫保存；5、疊氮鈉屬于有毒性物質(zhì)，在使用過程中需注意安全。
凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對(duì)這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。具有以下特點(diǎn)：1．凝膠層析操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。有時(shí)只要有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生過程便可重復(fù)使用。 2．分離效果較好，重復(fù)性高。**突出的是樣品回收率高，接近100％。3．分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對(duì)分離物的活性沒有不良影響。4．應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測(cè)定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102～105d；Sepharose類為105～108d。5．分辨率不高，分離操作較慢。
由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時(shí)流速必須嚴(yán)格把握。因而分離操作一般較慢。而且對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時(shí)還有非特異吸附現(xiàn)象。
凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中**常用的凝膠。 親脂性葡聚糖凝膠凝膠既親脂又親水，可在多種有機(jī)溶劑中膨脹。這種凝膠在pH＞2的不含氧化劑的溶液中穩(wěn)定。用低級(jí)醇為溶劑時(shí)，對(duì)芳香族、雜環(huán)族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時(shí)則可去除對(duì)上述化合物的吸附作用，而對(duì)含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用 。在G類凝膠上引入一些酸性或堿性基團(tuán)后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑 。聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺 和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過自由基引發(fā)聚會(huì)形成聚丙烯酰胺凝膠。 只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號(hào)的凝膠 。
凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細(xì)和超細(xì)四類。顆粒越細(xì)，分離效果越好，因?yàn)樗菀走_(dá)到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平變寬。
新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗(yàn)其均勻性－可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對(duì)光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應(yīng)盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，而使層析分辨率下降一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對(duì)分離造成明顯影響。對(duì)蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應(yīng)先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100 mL床體積加樣品20～30 mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。
樣品上柱是凝膠層析中**關(guān)鍵的一步。理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的巨型色譜帶。為了做到這一點(diǎn)，應(yīng)盡量減少加樣時(shí)樣品的稀釋以及樣品的非平流流經(jīng)凝膠層析床體。反之將造成色譜帶擴(kuò)散、紊亂，嚴(yán)重影響分離效果洗脫劑的流速對(duì)分離效果也有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線。#p#分頁標(biāo)題#e#
凝膠過濾層析遇見的問題及分析如下：
1．
流速慢：有氣泡、出水管阻塞、沒打開夾子、柱壓太緊（操作壓過大、長(zhǎng)期使用、接頭漏氣。
2．
柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡：上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流、接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊
3． 條帶扭曲：膠面不平、樣品或洗脫液中有顆粒、裝拄不均勻 4．
分辯率不高：裝拄不均勻、樣品量過大、流速太快、拄不垂直或拄不合適、長(zhǎng)菌、拄下口軟管太長(zhǎng)、膠不適當(dāng)。
凝膠層析主要根據(jù)被測(cè)樣品分子量的差異，在固定相上受到阻滯程度不同而達(dá)到分離的目的。分子量大的物質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)速度較快，先流出層析床，并在記錄儀上出現(xiàn)層析峰。反之，分子量小的物質(zhì)移動(dòng)速度較慢，后出現(xiàn)層析峰。實(shí)驗(yàn)中**個(gè)波峰是藍(lán)色葡聚糖2000kb,后一個(gè)則是牛血清蛋白70kb.。 鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡(jiǎn)單，保持樣品的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，這種方法已廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測(cè)定。其運(yùn)用如下：大連灣牡蠣蛋白的分離提取及分子量測(cè)定、地龍生物活性部位經(jīng)膜分級(jí)分離后降壓作用的比較研究、復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中目標(biāo)組分柱層析分離純化策略研究、桔梗多糖的分離純化與含量測(cè)定、聚丙烯酰胺凝膠柱分離制備低聚果糖單組分、庫(kù)拉索蘆薈多糖的提取及分離純化與活性研究、凝膠柱層析_考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定牛奶中的真蛋白質(zhì)、人工培養(yǎng)冬蟲夏草胞外多糖的分離純化研究等。
