摘要：本實(shí)驗(yàn)利用凝膠過濾的特點(diǎn)，先向?qū)游鲋屑尤隖eSO4 溶液，形成一個(gè)還原帶，然后加入血紅蛋白樣品（血紅蛋白與高鐵氰化鉀的混合液）。由于血紅蛋白分子量大，在凝膠床中流速快，當(dāng)其流經(jīng)還原帶時(shí)，褐色的高鐵血紅蛋白立即變?yōu)樽霞t色的亞鐵血紅蛋白。亞鐵血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液溶解的O2 結(jié)合，形成鮮紅色的氧合血紅蛋白。鐵氰化鉀是小分子量化合物，呈黃色帶遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落在后邊。這樣，就可以形象直觀地觀察到凝膠過濾的分離效果。 關(guān)鍵詞:凝膠柱，抗凝血，磷酸緩沖溶液
凝膠過濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質(zhì)的層析方法，又稱分子篩層析或排阻層析。目前常用于凝膠過濾的的凝膠類介質(zhì)主要有4大類，即葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠等層析介質(zhì)。它們都是不溶于水的高聚物，內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以Sephadex為例，它是由一定平均分子量的葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)生成的高聚物，網(wǎng)眼的大小由葡聚糖的分子量與環(huán)氧氯丙烷的用量來控制。葡聚糖的分子量越大、環(huán)氧氯丙烷用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠的網(wǎng)眼越小。Sephadex有很強(qiáng)的親水性，在水或緩沖液中能吸水膨脹。交聯(lián)度越大，網(wǎng)眼越小，吸水量也越少。本實(shí)驗(yàn)利用Sephadex將血紅蛋白從雞血中進(jìn)行分離，通過層析柱可以形象的看見分離的過程。 1、實(shí)驗(yàn)材料及試驗(yàn)方法
1.1實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、移液管、膠頭滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH試紙、電子天平、層析柱、洗耳球、鐵架臺(tái)、鑰匙、稱量紙 1.2實(shí)驗(yàn)試劑
（1）磷酸緩沖液（PH 7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸餾水中，定容**1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：稱取2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容**100mL。
（3）40m mol/L FeSO4 溶液:稱取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用時(shí)現(xiàn)配）。
（4）Sephadex G－25，或G-75 （5）固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕
（6）抗凝血（哺乳動(dòng)物血樣，以1：6的比例加入2.5%檸檬酸鈉，置于4℃冰箱中保存）。 1.3實(shí)驗(yàn)方法
（1）凝膠溶脹（該步驟有老師在實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備）
（2）裝柱：將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內(nèi)加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當(dāng)體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時(shí)開啟螺旋夾，控制一定流速。**好連續(xù)裝完凝膠，若分次裝入，需用玻棒輕輕攪動(dòng)柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面影響分離效果。裝柱后形成的凝膠床**少長(zhǎng)30cm，使膠床表面保持2-3cm液層。
注意：整個(gè)操作過程中凝膠必須處于溶液中，不得暴露于空氣，否則將出現(xiàn)氣泡和斷層，應(yīng)當(dāng)重新裝住。
（3）平衡：繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。
（4）樣品制備：
①取1ml雞的抗凝血放入小燒杯中，加5ml pH7.0 的磷酸緩沖液，再加入27.5mg K3Fe(CN)6 固體，用玻棒攪動(dòng)使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。
②吸取 1ml FeSO4 溶液和 1ml EDTA-Na2-NaHPO4 溶液，于小燒杯中混勻。（注意：還原劑混合液要新鮮配制，盡可能縮短其與空氣接觸的時(shí)間）。
（5）上樣：旋開層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進(jìn)入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時(shí)，立即加入0.4ml上述混合液，待其進(jìn)入膠床表面僅留約1mm液層時(shí)，加入0.5ml緩沖液，再當(dāng)膠床表面僅留約1mm液層時(shí)，吸取0.5ml血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央，注意切勿沖動(dòng)膠床。慢慢打開螺旋夾，待大部分樣品進(jìn)入膠床、床面上僅有1mm 液層時(shí)，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進(jìn)入膠床，然后用液管小心加入3～5cm 高的洗脫緩沖液。
6．洗脫：繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。
7．凝膠的回收：實(shí)驗(yàn)完畢用洗脫液把柱內(nèi)有色物質(zhì)洗脫干凈，保留凝膠柱重復(fù)使用或回收凝膠。 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
從實(shí)驗(yàn)過程可以清楚滴看見凝膠過濾的分離效果。當(dāng)裝柱完成后，shou先加入的是磷酸緩沖液，洗脫一定時(shí)間后，再加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液;此時(shí)凝膠柱內(nèi)會(huì)有一段黃色帶，當(dāng)此黃色帶再磷酸緩沖液的洗脫下完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再加入的是血紅蛋白樣液，這時(shí)可以看見之前的黃色帶上面是緊跟著的是紅色條帶;再當(dāng)此紅色條帶完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，可以看見，紅色條帶會(huì)慢慢下移，然后與黃色條帶重合，之后再超過黃色條帶，以較快速度繼續(xù)向下移動(dòng)，整個(gè)過程可以清楚的看見紅黃兩個(gè)明顯的條帶。**后，紅色條帶會(huì)先于黃色條帶被洗脫出來。將洗脫出來的紅色洗脫液與之前配制的高鐵血紅蛋白（稀釋10倍）分別進(jìn)行掃描，得到的曲線如下：
②此為高鐵血紅蛋白稀釋10倍后掃描所得曲線 3、討論
現(xiàn)將具體分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)利用凝膠過濾的特點(diǎn)，當(dāng)加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液時(shí)，shou先形成的是一個(gè)還原帶，加入血紅蛋白樣液（此樣液即是血紅蛋白與高鐵氰化鉀的混合液）后，由于血紅蛋白分子量大，在凝膠床中流速快，當(dāng)其流經(jīng)還原帶時(shí)，褐色的高鐵血紅蛋白立即變?yōu)樽仙膩嗚F血紅蛋白，亞鐵血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液中溶解的氧結(jié)合，形成鮮紅的氧合血紅蛋白，而鐵氰化鉀分子量小，呈黃色帶遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落在了后面。試驗(yàn)過程中紅色帶在穿越黃色帶的前后顏色變化并不明顯，但還是可以明顯的將黃色帶與紅色帶區(qū)分開來。#p#分頁標(biāo)題#e#
