離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。 （一）原理
在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽離子纖維素—O—C6 H14N+H，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時(shí)，可置換陽離子，稱為陽離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－O－CH2－COO一
），其反離子為陽離子（如Na+等）,可與帶正
電荷蛋白質(zhì)陽離子進(jìn)行交換。
溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，但各種蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的程度有所差異，以白蛋白為**多，依次為 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。
在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開來。
交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機(jī)鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當(dāng)Cl一
的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl一
濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。 （二）常用離子交換劑的種類與特性
1.離子交換纖維素 離子交換纖維素的種類很多，其種類與特性如表1－1所示。
表1-1 離子交換劑的類型與特點(diǎn)
在交換纖維素中，**常用的是DEAE—纖維素和CM纖維素。由于劑型不同，其理化性質(zhì)和作用也有所差異。一般而言，微粒型要優(yōu)于纖維素型，因?yàn)槲⒘Ｐ褪窃诶w維素型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提煉而成。它的交換容量大，粒細(xì)、比重大，能裝成緊密的層析柱，要求分辨力高的實(shí)驗(yàn)可用此型纖維素（見表1－2）。
表1-2 商品DEAE—纖維素和C M纖維素的類型和特性
2．離子交換交聯(lián)葡聚糖 離子交換交聯(lián)葡聚糖也是廣泛使用的離子交換劑，它與離子交換纖維素不同點(diǎn)是載體不同，常用交聯(lián)葡聚糖的類型與特性見表1-3。
表1-3 常用交聯(lián)葡聚糖的類型與特性
離子交換交聯(lián)葡聚糖有如下優(yōu)點(diǎn)：①不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活；②非特異性吸附少；③交換容量大。
離子交換葡聚糖的選用，一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般選A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜選用A25和C25。 （三）試驗(yàn)方法
陰離子交換劑與陽離子交換劑的裝柱和層析過程基本相同。交聯(lián)葡聚糖的預(yù)處理只需充分溶脹和平衡，不需要除去細(xì)粒碎片和酸堿處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。
1．劑型的選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)在所用緩沖液pH值下帶電荷的種類選擇，如pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，應(yīng)選陰離子交換劑，反之應(yīng)選陽離子交換劑。一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白，而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。
下面以DEAE-纖維素操作為例，介紹試驗(yàn)方法
2．膨脹活化 此步的目的在于除去雜質(zhì)，暴露DEAE-纖維素上的極性基團(tuán)。DEAE-纖維素的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過柱樣品的量來決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當(dāng)于6ml～8ml柱床體積。
表1－4 分離的血清與所需DEAE—纖維素量及其他條件的大致關(guān)系
稱取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纖維素干粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時(shí)攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直**濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同樣抽濾液**近中性。再將纖維素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同樣處理，洗**中性。 #p#分頁標(biāo)題#e#
3．平衡 將DEAE—纖維素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始緩沖液），靜止1h，不時(shí)攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次**傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時(shí)為止。
4．裝柱 層析柱的選擇要大小、長度適當(dāng)。一般而言，柱長和柱直徑之比為10︰1～20︰1，柱的內(nèi)徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內(nèi)浸泡處理24h，然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。 裝柱時(shí)，先剪一塊圓形的尼龍紗布（直徑與層析柱內(nèi)徑一致），放入層析柱底部。將柱下端連接細(xì)塑料管，夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩沖液**一半的柱高，除去死區(qū)及塑料管內(nèi)的氣泡。再將平衡的DEAE－纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡應(yīng)排除或重裝。擰開螺旋夾，使流速**1ml/5min，待緩沖液快接近纖維素面時(shí)，繼續(xù)倒入纖維素糊，同時(shí)用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的纖維素形成分界層，通過進(jìn)出緩沖液調(diào)節(jié)流量，也可通過塑料管的升降來控制，**柱床體積不變?yōu)橹?。剪一圓形濾紙（與柱內(nèi)徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接于纖維素床表面，以免在加樣時(shí)打亂纖維素層。裝好柱的柱面應(yīng)該是平整的，無傾斜，整個(gè)柱床內(nèi)無氣泡、不分層。繼續(xù)平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。
5．上樣 要層析的樣品shou先必須用起始緩沖液（4℃）平衡過夜，中間可換液數(shù)次。將柱的上端打開，用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入交換劑中，快要進(jìn)完時(shí)，加1ml～2ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
樣品的加量與DEAE—纖維素有一個(gè)**適比的關(guān)系，超過這個(gè)比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經(jīng)過粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重約4g DEAE－纖維素裝柱分離，可獲得理想結(jié)果。 6．洗脫 對于陰離子交換劑而言，洗脫的辦法是使pH逐漸降低，而離子濃度逐漸升高。一般的辦法，是穩(wěn)定一個(gè)因素而改變另一個(gè)因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續(xù)洗脫法，前者較實(shí)用，后者較準(zhǔn)確。
