1. 組合柱層析色譜法、HPLC分析 

Li Rui[1]等 X-5樹脂和Sephadex LH-20結(jié)合的方法從V. uliginosum berry里分離純化得到11種花青素和兩種多酚。具體操作方法：25 mL提取液過X-5樹脂（乙醇，0.5%TFA處理），然后用0.5 % TFA (v/v)去離子水沖洗2次去除多糖，有機(jī)酸等水溶性雜質(zhì)；接著多酚由乙酸乙酯洗脫回收，0.5% TFA (v/v)乙醇洗脫4次回收得到花青素。濃縮得到的花青素采用Sephadex LH-20色譜柱進(jìn)一步純化，采用含有 0.5% TFA的30%乙醇水溶液為洗脫溶劑。洗脫下來的片段采用分光光度法在525nm處檢測。每部分洗脫液在35 oC真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（RE-52AA, Yarong, Shanghai, China) **干燥，然后再用0.5% TFA (v/v) 溶液溶解，分析前-20 o

C下保存。分析方法為HPLC–DAD-ESI-MS 和MS/MS 

**二雷[2]等也分別采用組合層析和半制備型高效液相色譜的方法從野生藍(lán)莓中分離得到高純度的花青素混合物和單體。利用 UV-vis 和高效液相色譜對花青素含量進(jìn)行檢測，利用 HPLC 和 HPLC-DAD-ESI-MS/MS 對純化樣品中的花青素進(jìn)行種類鑒定。 

shou先，將野生藍(lán)莓粗提液用乙酸乙酯萃取4次，將萃取之后的水相上

Amberlite XAD-7HP (20–60目， Sigma-Aldrich)陽離子交換柱（2.6 cm?50 cm）。然后用2 L含0.01% HCl 的去離子水以1 mL/min的流速沖洗柱子，以去大部分的除多糖，有機(jī)酸，蛋白和離子。用1 L 35%的酸化乙醇溶液（0.01% HCl）做為洗脫液，流速為1.5 mL/min進(jìn)行洗脫。根據(jù)柱中顏色邊界層以及在520 nm處的UV-vis檢測結(jié)果進(jìn)行洗脫液的收集，再濃縮（不超過40 oC），冷凍干燥制得花青素粗提物。用300 mL 60–80% 乙醇溶液 (0.01% HCl)將弱極性的花青素和其他酚類進(jìn)行完全洗脫，備用。 

然后，取0.1 g 經(jīng)上一步樹脂純化的色素粗提物用20 mL去離子水溶解，上Sephadex LH-20層析柱（1.0 cm × 60 cm; Sigma Chemical Co., St. Louis,MO, USA），用1 L 25% 乙醇溶液(0.01%HCl)以1.2 mL/min的流速洗脫，并用10 mL試管收集洗收集不同組分，分別濃縮、冷凍干燥制得藍(lán)莓花青素純化樣品。 

**后，為了得到花青素的單體，將LH-20分離得到的各部分樣品經(jīng)半制備型高效液相色譜進(jìn)一步純化，得到高純度的花青素單體。 

研究優(yōu)點(diǎn)：此采用采用乙醇，乙酸乙酯，鹽酸等無毒或低毒溶劑，取代了常規(guī)的劇毒有機(jī)溶劑比如甲醇，丙酮，三氟乙酸等。 

同樣的Giuliana Catalano[3]， Luis Cabrita[4]， Zhaoqi Zhang[5]等人也采用Amberlite XAD-7樹脂和Sephadex LH-20柱層析的方法分別從毛野豌豆的花瓣、藍(lán)莓和荔枝果皮中分離得到花青素；**峰[6]采用柱層析法對黑花生衣色素進(jìn)行分離純化，方法流程為：黑花生衣→50%甲醇(含0.1%三氟醋酸)浸提→濃縮→乙酸乙酯萃取→脫有機(jī)溶劑→XAD-7HP大孔樹脂純化→聚酰胺純化→葡聚糖凝膠LH-20純化→得到兩種色素單體；Gary R. Takeoka[7]等從黑豆中用固相萃?。ü柙逋粒┖椭苽湫虷PLC法分離得到了3種花青素。 2. 高速逆流色譜和柱層析結(jié)合法 

Andreas[8]等人采用Amberlite XAD-7樹脂和高速逆流層析（HSCCC）的方法從玫瑰茄，紫甘藍(lán)，黑醋栗，黑果梨等中分離得到多種花青素，并對其抗氧化性能進(jìn)行測試篩選。具體過程為：先用Amberlite XAD-7層析柱 (50 cm*4 cm, Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) 對花青素粗提液進(jìn)行初步純，洗脫液組成為甲醇/乙酸(19:1, v/v)。洗脫液在真空下濃縮，然后冷凍干燥保存。接著采用高速逆流色譜進(jìn)一步純化，高速逆流色譜設(shè)備配備3個串聯(lián)的制備線圈（d=2.6 mm, V= 850 mL），轉(zhuǎn)速為1000 rpm，所用的溶劑體系組成為叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水（2:2:1:5），并用三氟乙酸酸化，流速為5 mL/min，之前冷凍干燥的花青素產(chǎn)品用1:1體系的輕相和重相溶解，由環(huán)式注射器進(jìn)樣。HPLC-DAD, TLC, ESI-MS/MS和1H NMR分析方法用來檢測分離的花青素的純度及分子式。 

Koichi[9]等建立了一套高速逆流色譜分離方法實(shí)現(xiàn)了花青素的純化分離。 兩相溶劑系統(tǒng)的優(yōu)選。 

Bo Li[10]等采用高速逆流色譜和C18反向色譜連用的方法從黑米中分離得到純度高達(dá)94.38% 的Cyanidin-3-O--d-glucoside花青素。 具體方法： 

（1）LC–UV–MS/MS( LC/MSD trap----Liquid Chromatography/Mass Spectrometer Detector ion trap) 液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀離子阱方法鑒定花青素種類，設(shè)備：Agilent 1100 series（Palo Alto, CA, USA）配備ESI（electrospray ionization source）電噴射粒子化器和一個DAD(diode-array detector)二極管陣列檢測器；所用分離柱材料為YMC ODS-AQ 柱 (3 ?m, 150 mm×4.6 mm i.d., Kyoto, Japan). 流動相A為甲酸/(8.5:91.5, v/v)，B相甲酸/甲醇/乙腈/水(8.5:22.5:22.5:41.5, v/v/v/v)。 

（2）HPLC法對高速逆流色譜兩相溶劑系統(tǒng)的優(yōu)選。根據(jù)分配系數(shù)（K）所用兩相溶劑系統(tǒng)的組成為：水-正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-三氟乙酸。**佳比例根據(jù)分配系數(shù)K和固定相的保留比例確定。 

（3）經(jīng)高速逆流分離得到的產(chǎn)品進(jìn)一步用反向C18色譜進(jìn)一步純化，得到花青素單體。YMC PACK ODS-AQ C18 column (50 ?m, 50 cm×3 cm i.d.)， 洗脫劑為含0.1% TFA的22%甲醇，流速為2 mL/min。（4）**后再由核磁的碳普氫普確認(rèn)所分離物質(zhì)。    

參考文獻(xiàn) 

[1] Li, R., Wang, P., Guo, Q.Q. and Wang, Z.Y., Anthocyanin composition and content of the Vaccinium uliginosum berry, Food Chemistry, 2011, 125(1), 116-120. 

[2] Wang, E.L., Yin, Y.G., Xu, C.N. and Liu, J.B., Isolation of high-purity anthocyanin mixtures and monomers from blueberries using combined chromatographic techniques, Journal of Chromatography A, 2014, 1327(31), 39-48. #p#分頁標(biāo)題#e#

[3] Catalano, G., Fossen, T., and Andersenc, Ø.M., Petunidin 3-O-α-Rhamnopyranoside-5-O-β-glucopyranoside and other anthocyanins from flowers of vicia villosa, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46 (11), 4568–4570. 

[4] Cabrita, L., Frøystein , N.Å., Andersenc, Ø.M., Anthocyanin trisaccharides in blue berries of vaccinium padifolium, 2000, 69(1), 33-36. 

[5] Zhang, Z.Q., Pang, X.Q, Yang, C., Jia, Z.L. and Jiang, Y.M., Purification and structural analysis of anthocyanins from litchi pericarp, Food Chemistry, 2004, 84(4), 601–604.