表16-6 按層析原理分類
二、層析法實驗技術(shù) （一）凝膠層析法
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。如果實驗?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們在分配系數(shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用
Sephadex G-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果實驗?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中**高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，**后得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質(zhì)宜在30-40之間。 ⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫**近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。 凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦校缓笤谖⑽⒌財嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應(yīng)低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過**終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。 ⒌凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。 #p#分頁標題#e#
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡**乙醇濃度達90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。 ⒍凝膠層析的應(yīng)用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。 ⑶測定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標準曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時，可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標準曲線上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。 （二）離子交換層析法
離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。
⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使**終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使**終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡**所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直**達到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中**簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。**好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放于同一水平上，**個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，**個容器與柱相連，當溶液由**容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與**容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。**容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊洗脫餾份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學(xué)測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。
#p#分頁標題#e#
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/l NaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產(chǎn)品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科*域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。 （三）高效液相層析法
高效液相層析法（HPLC）是近二十年來發(fā)展起來的一項新穎快速的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進了氣相層析的理論具有氣相層析的全部優(yōu)點。由于HPLC分離能力強、測定靈敏度高，可在室溫下進行，應(yīng)用范圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物均可用此法測定。對蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤為有利。 高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。
⒈高效液相
層析儀典型的高效液相
層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測系統(tǒng)三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：①流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。②能抗溶劑腐蝕。③有較高的輸出壓力，一般要達到15～300kg/c，也有的高達800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩臺高壓泵，一臺輸送強溶劑，一臺輸送弱溶劑，兩泵運轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進樣，也可采用六通閥門進樣。HPLC中所用的檢測器**多應(yīng)用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達ng水平。此外，還有熒光檢測器、示差析光檢測器、電化學(xué)檢測器等。 ⒉HPLC的類型與應(yīng)用
⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。流動相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。
⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學(xué)鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析?；瘜W(xué)鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團，氰基、氨基及雙羥基三種。流動相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機鹽緩沖液。**常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而**的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。離子對分配層析分：①正相離子對層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動相為極性較低的有機溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機相中進行分配，而達到分離。本法優(yōu)點是流動相選擇余地大，缺點是固定相易流失。②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對離子同時存在于強極性的流動相中，生成的中性離子對在流動相和鍵合相之間進行分配，而得到分離。本法優(yōu)點是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。 ⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值**好在被分離酸、堿的pK值附近。 （四）親和層析法
親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。
具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等。可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當含有混合組份的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出，然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價連接的化合物稱配基。 #p#分頁標題#e#
親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。
親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應(yīng)用的一個重要方面。
應(yīng)用實例：2-胰凝乳蛋白酶的提純
⒈親和吸附劑（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制備取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。攪拌混合物，滴加2-8mol/l NaOH，使溶液pH維持在11.0。20℃左右，8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷的0.1mol/l NaHCO3（pH9.0）溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/l NaHCO3（pH9.0并在冰箱中預(yù)冷）溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的**大用量為每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃緩慢攪拌約24小時，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗**沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/l Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中保存?zhèn)溆谩?nbsp;
⒉分離 親和吸附劑裝柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于同樣緩沖液中并上柱，再應(yīng)用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時，直**280nm無光吸收時停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液（pH3.0）洗脫。 （五）聚焦層析法
聚焦層析是一種操作簡單、廉價的層析技術(shù)。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點不同進行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點。聚焦層析所用的凝膠shou先用高pH溶液平衡，然后用多元緩沖液進行洗脫，多元緩沖液pH呈梯度下降。
聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑（PBE）。其中MONOP是帶孔小珠，孔中被帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的介質(zhì)。各種凝膠性質(zhì)見表16-8。
表16-8 聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)
NONOP可制成兩種高效液相柱：MONOp HR5/5(1ml)，和MONOp HR5/20(5ml)。使用時根據(jù)樣品復(fù)雜性選擇相應(yīng)的柱。HR5/5分辨率為pI>0.2，HR5/20pI>0.02。
多元緩沖液交換劑PBE，屬珠狀交換劑凝膠，有PBe 118（pH11-8）和PBE（pH9-4）。在聚焦層析時，通過使用不同的洗脫液，可使交換容量發(fā)生改變，并且使pH達到更廣的范圍。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三方面來闡述。 1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠
梯度混合儀實現(xiàn)的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室（這層析柱者）中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由于交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時，先用起始緩沖液（配方見表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(zhì)（作流動相）的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性**強的組分與堿性陰離子交換對結(jié)合發(fā)生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內(nèi)每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降**6，并**后恒定于此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。 2．蛋白質(zhì)的行為
蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點（PI）和層析柱中的PH值。當柱中的PH低于蛋白質(zhì)的PI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當?shù)鞍踪|(zhì)移動**環(huán)境PH高于其PI時，蛋白質(zhì)由帶正電行變?yōu)閹ж撾姾?，并與陰離子交換劑結(jié)合。由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境PH 再次低于PI時，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)進行，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結(jié)合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的 離子交換層析法 （Ion exchange chromatography）
這個部份，我們分成四個項目說明離子交換層析法。
1. 1. 基本原理：包括離子交換法的原理和步驟。
2. 2. 樹脂材質(zhì)：介紹常用的陰陽離子交換樹脂成份。 #p#分頁標題#e#
3. 3. 離子交換劑的選擇：如何選用適當?shù)年帲枺╇x子交換劑和緩沖液。 4. 4. 離子交換樹脂的前處理：使用樹脂前的注意事項和處理方法。 一、基本原理
離子交換層析法 （ion exchange chromatography，簡稱IEC）是從復(fù)雜的混合物中，分離性質(zhì)相似大分子的方法之一，依據(jù)的原理是物質(zhì)的酸堿性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質(zhì)，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。
離子交換層析法大致分為5個步驟： 1. 1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。 3. 3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結(jié)合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。
4. 4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應(yīng)是可逆的，遵循化學(xué)平衡的規(guī)律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由于連續(xù)添加新的交換溶液，所以會朝正反應(yīng)方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質(zhì)是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結(jié)合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結(jié)合力減弱，**后被洗下來。由于不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，**先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時），隨后是中性氨基酸，如glycine和alanine。堿性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現(xiàn)。
－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型樹脂含有－COOH或－OH。 陽離子交換樹脂進行的反應(yīng)如下：
2. 2. 陰離子交換樹脂
分為強堿型、中強堿型和弱堿型三類，含有銨鹽，四級銨鹽 [ －N+(CH3)3] 為強堿型樹脂，三級以下銨鹽 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都屬弱堿型樹脂；同時具有強堿和弱堿型基團的，為中強堿型的樹脂。陰離子交換樹脂進行的反應(yīng)如下：
除了樹脂以外，纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）也是常用的離子交換材質(zhì)，特性是具有親水性和較大的表面積，對生物活性物質(zhì)而言，是一個較為溫和的環(huán)境，同時也是大分子所適用的分離純化材質(zhì) 。常用的種類如下：
實驗證明，纖維材質(zhì)對蛋白質(zhì)和核酸的分離純化效果相當好，因為離子交換纖維的種類多，能依據(jù)不同分離目的使用，且功能團基主要在表面，對生物大分子的交換十分有利。
三、離子交換劑的選擇
離子交換劑的選擇，shou重保持欲分離物質(zhì)的生物活性，以及在不同pH值環(huán)境中，此物質(zhì)所帶的電荷和電性強弱。
1. 1. 陰陽離子交換劑的選擇
若被分離物質(zhì)帶正電荷，例如polymyxin、 cytochrome C這些堿性蛋白質(zhì)，它們在酸性溶液中較穩(wěn)定，親和力強，故采用陽離子交換劑；其它像heparin、nucleic acid這類酸性物質(zhì)，在堿性溶液中較穩(wěn)定，則使用陰離子交換劑；如果欲分離的物質(zhì)是兩性離子，一般考慮在它穩(wěn)定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。以胰島素（insulin）為例，它的等電點為pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用陽離子交換劑，在pH>5.3的堿性溶液中，使用陰離子交換劑。
簡言之，已知等電點的物質(zhì)，在高于等電點的pH條件下，因帶有負電荷，應(yīng)采用陰離子交換，在低于等電點的pH下，則采用陽離子交換。未知等電點的物質(zhì)，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快的物質(zhì)可被陽離子交換劑吸附。
2. 2. 緩沖液的選擇
緩沖液酸堿度的選擇，決定于被分離物質(zhì)的等電點、穩(wěn)定性、溶解度和交換劑離子的pK值。使用陰離子交換纖維時要選用低于pK值的緩沖液，若欲分離的物質(zhì)屬于酸性，則緩沖液的pH值要高于該物的等電點；用陽離子交換纖維時要選用高于 pK值的緩沖液，目的物屬于堿性物質(zhì)的話，緩沖液要低于該物等電點的pH值。 #p#分頁標題#e#
緩沖液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發(fā)生沉淀為原則，如使用UV吸收法測樣品，那么pyridine或barbital這類會吸收UV的物質(zhì)就不適用。
四、離子交換樹脂的前處理
離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內(nèi)之雜質(zhì) ，并以NaOH和HCl處理樹脂，使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹脂先以15倍于樹脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，同樣以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。陽離子交換樹脂用15倍于樹脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。
